中医辅助治疗强直性脊柱炎(as)由来已久。本研究从中药注射剂中提取中药成分和靶向蛋白，以此构建PPI网络，推断Y-Y-T、AS治疗药物、AS患者差异表达基因与AS疾病蛋白之间的关系。对Y-Y-T治疗AS的机制进行了系统的研究，为理解中医药理学提供了新的视角。
强直性脊柱炎(AS)是一种慢性风湿性疾病，在世界范围内发病率为0.2-0.5%。到目前为止，AS的发病机制尚不清楚，据报道其发病机制与革兰氏阴性菌、人白细胞抗原B27(HLA-27)、模式识别受体(PRRs)和炎症性肠病(IBD)有关。AS的药物治疗主要包括以下三类:非甾体抗炎药(NSAIDs)、疾病修饰性抗风湿药(DMARDs)和生物制剂。这些药物治疗可在一定程度上缓解炎症反应，减轻骶髂关节和脊柱疼痛，延缓疾病进展。但长期服用这些药物也可能导致系统性副作用，如严重感染和胃肠道不耐受。
AS是一种致病因素复杂的疾病。为了阐明Y-Y-T在AS治疗中的潜在作用机制，作者深入分析了分子式的组成，构建了PPI网络，揭示了分子式靶点与AS相关蛋白之间的相互关系，并预测了Y-Y-T的潜在关键靶点。
草药成分和Y-Y-T的作用靶标
一般认为，脾、肾、督脉在中医认知中与AS进展风险密切相关。为了揭示该方的潜在治疗机制，作者从中药中提取了种中药成分(补充表S4)。研究了部分成分的作用。例如，穿龙薯蓣的一种成分discin可以通过减少Th1/Th修复受损的滑膜组织，调节let7i/TLR4/MyD88的microRNA信号通路，逆转炎症性肾损伤。落新丁是从菝葜中提取的生物活性化合物，通过上调调节性T细胞和下调Th17细胞降低抗原特异性自身抗体，并通过降低MHCII类表达降低抗原提呈细胞效率。
种成分中，种从单根中提取，7种从具有累积效应的单根中提取(图1)。如金银花和*芪共有2种化合物γ-谷甾醇和β-谷甾醇，*芪、苍术中有腺嘌呤核苷和尿苷，金银花、*连中有绿原酸。有趣的是，大多数常见成分通过降低肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)和白细胞介素6(interleukin6,IL-6)的产生、防止白细胞外渗和抗菌作用等多种途径降低炎症反应。
草药之间的关系然后提取了与tcid和STITCH成分高度相关的靶标(补充表S5和6)。总共发现80种成分对个蛋白有影响。个目标是成分共享的，其他个目标是独特的。白藜芦醇、反式白藜芦醇、槲皮素等几个小分子似乎具有相似的特征，因为它们拥有70多个相同的靶向蛋白。
成分之间的关系。在网络中出现了3个以上的成分共享目标。线条的宽度表示各成分之间共享目标的数量。
Y-Y-T靶标的功能分析
采用基因本体论(GO)分析和KEGG通路分析对该方的主要疗效进行分析。GO分析结果(补充表S7)显示，Y-Y-T的靶点主要与5个部分有关，即催化活性、转运蛋白活性、受体活性和分子传感器活性以及结合(图3)。具体为肝素结合(p=1.20E-11)、肽受体活性、g-蛋白偶联(p=1.20E-09)、神经肽激素活性(p=3.10E-06)与AS密切相关。例如，血管活性肠多肽中的神经肽在神经内分泌-免疫-胃肠系统中起着重要作用，含镁髓内钉有修复骨质疏松的能力。丰富的条件说明了该配方在治疗乳酸菌中的重要作用。
Y-Y-T前二十的靶标分类80条丰富的KEGG通路(补充表S8)可分为6类，包括人类疾病、生物系统、环境信息加工、代谢、遗传信息加工和细胞过程。在人类疾病组，炎症性肠病(IBD)(P=5.10E-03)和类风湿关节炎(RA)(P=1.00E-02)与AS显著相关。由于遗传和免疫背景相似，IBD与AS的发病机制相似。此外，RA和AS患者具有共同的骨代谢生物标志物和症状。此外，免疫系统的一些通路与AS的发病有关。例如，在炎症环境中，AMPK(p=5.00E-04)和TLR信号通路(p=7.30E-04)的激活会促进AS的发生。T细胞受体信号通路(P=9.10E-04)参与髋关节韧带骨化。
Y-Y-T靶点与其他AS药物靶点、AS疾病蛋白及AS患者差异表达基因的比较
为了探讨Y-Y-T治疗AS的潜在机制，作者对四个数据集进行了比较。从GEO数据库下载基因表达谱GSE。采用多元比较的Benjamin-Hochberg校正t检验来鉴别DEGs（差异表达基因），结果产生了个deg(补充表S9)。其他3个数据集，包括个Y-Y-T配方靶标，19个FDA批准的AS相关药物的88个靶标(表S10)和个AS疾病基因(表S11)，均从相关公共数据库中检索。如图4所示。TNF(肿瘤坏死因子)是四组中唯一共享的靶标，显然是治疗中的关键蛋白。
分子式靶标、疾病基因、靶标基因重叠由疾病基因编码的蛋白质和配方靶标之间的关联网络
为了进一步探索其作用机理，作者应用PPI网络揭示了分子筛靶蛋白与疾病蛋白之间的功能关系。个配方靶蛋白和疾病基因编码的77个蛋白组成对PPIs。（如图5），两组之间重叠的蛋白[JAK2]（januskinase2）、[STAT3]（信号转换器和转录激活器3被定义为必需靶蛋白。17个节点(13个公式靶点、2个基本靶点和2个AS疾病基因)形成高度连通集合。
在这一集合中，JAK2和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)由于高度关联而起到枢纽作用。JAK2和STAT3都是IL-23通路的调节因子，IL-23通路是AS的重要病因，而EGFR被认为是治疗AS的靶点，与as的发病有关。JAK2、信号传感器和转录激活因子1(STAT1)、SHC-adaptor蛋白(SHC)、蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)共同参与了免疫介导的炎症性疾病。热休克蛋白90家族A类成员1(HSP90AA1)是与4种疾病蛋白直接或间接相关的靶蛋白。HSP90AA1靶向药物可通过阻断炎症、细胞因子产生、蛋白激酶活性和血管生成信号通路来平衡炎症-免疫系统。
Y-Y-T和疾病基因的聚类PPI网络目标与公式目标之间的目标关联网络
两个数据集合共形成个Y-Y-T靶标和1,个DEGs之间的90个重叠靶标和13,对PPIs。79%的Y-Y-T靶标与60%的DEGs相关。这90个Y-Y-T靶标中，有41个上调，49个下调。如图6所示，血影蛋白,non-erythrocytic1(SPTBN1)是连接其他25个节点，包括雌激素受体1(ESR1)、神经营养受体酪氨酸激酶1(NTRK1)、磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)等的枢纽。ESR1与as的低骨密度(BMD)有关。NTRK1参与疼痛机制，PTEN激活与AS患者骨代谢相关的PI3K/Akt信号通路。该配方可能作用于上述蛋白，干预AS的进展。
聚类PPI网络的Y-Y-T公式和DEGs个Y-Y-T靶点与68个药物靶点相互作用，在两个数据集之间有34个蛋白重叠，包括Etanercept中的TNF和前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)，NFKB抑制剂等。这些药物均为AS治疗过程中的常规药物，其作用机制在剂型上类似。如图7所示，hub靶点TNF与其他10个靶点连接。TNF是一种参与全身炎症的细胞因子，抗TNF药物在临床上广泛用于风湿病。另一个药物靶点NFKBIA及其启动子多态性与AS的发病有关。此外，分子靶向保守螺旋-环-螺旋泛在激酶(CHUK)具有抗TNF的作用，有助于控制炎症。这些结果说明了AS药物靶点与Y-Y-T靶点结合可提高疗效。
Y-Y-T和药物靶点的簇PPI网络结论
本研究通过对Y-Y-T的中草药、化合物和靶点的层层深入分析，进一步分析Y-Y-T的潜在治疗机制。发现有11种中草药中有一些常见的化合物，如白藜芦醇、反式白藜芦醇、槲皮素等70多种蛋白质的化合物似乎是和治疗相关的治疗关键化合物。例如，白藜芦醇可以抑制肺炎克雷伯菌的生长，克雷伯菌是AS的炎症触发器，而槲皮素具有抗炎和镇痛作用。同时，IL-6、TNF、PTGS2等靶标可共同作用且具有累积效应。IL-6、TNF、PTGS2是由多种免疫细胞分泌的经典促炎细胞因子，与疾病活动或一些炎症标志物有关。而*连素和迎春花素可抑制IL-6、TNF和PTGS24的表达和分泌。
功能分析表明，Y-Y-T显著富集于氧化石墨烯分子传感器活性、受体活性、结合以及与免疫、炎症和代谢相关的通路，如代谢通路、TLR信号通路、AMPK信号通路、T细胞受体信号通路等。这些通路大部分参与AS的发病机制，而TNF信号通路等其他通路与AS的发病有关，补体和凝血级联作用涉及36个靶点，与免疫保护和调节功能有关。
我们发现超过5种化合物共享13个药物靶点。其中，TNF、PTGS2、CYP1A1(细胞色素P家族1亚家族A成员1)是中药材中高频出现的枢纽靶点，并产生叠加效应。药物靶点和方剂靶点之间的PPI网络说明了Y-Y-T增强西药疗效的潜在机制。此外，在四个数据集合之间构建PPI网络，并在每个网络中选择枢纽蛋白，这四个数据集合形成了一个复杂的网络，表明分子式靶标与AS关系密切，提示JAK2、STAT3、HSP90AA1、TNF、PTEN等蛋白是PPI网络中的关键靶标。
对于这些靶标，可利用TCMIP平台可获得靶标基因集，并进一步开展以下富集分析：
①Reactome-Pathway——依托Reactome数据库的Pathway信息，筛选目标中药（或方剂）候选靶标基因显著参与的分子通路；
②GO-BiologicalProcess/MolecularFunction/CellularComponent——依托基因本体数据库（GO），筛选目标中药（或方剂）候选靶标基因显著参与的生物学反应、所行使分子功能及其所在细胞内定位；
③ETCM-Diseases/HumanPhenotypes——依托ETCM数据库的疾病和表型数据库，筛选目标中药（或方剂）靶标基因显著相关的疾病和表型。
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